چپ
پس از خونگیری در پایان دوره تمامی حیوانات با عمیق تر کردن بیهوشی کشته شدند و سپس با اسکالپل روی تیبیا برش داده شد و ماهیچه های روی تیبیا کنار زده شد، پس از کنار زدن تمامی بافت های نرم استخوان تیبیا برداشته شد و تیبیای راست به درون ظروف پلاستیکی که دارای شماره هر موش است و حاوی فرمالین است گذاشته شد و ظروف برای انجام عملیات بعدی به درون یخچال انتقال داده شدند.
همچنین تیبیای چپ داخل نایلکس های کوچک بسته بندی شد و تا زمان تهیه عکس رادیوگرافی در یخچال نگهداری شدند.

4-3-3- اندازه گیری کلسترول تام
1-4-3-3-آماده سازی نمونه ها
میکروتیوب های اپندورف حاوی سرم خون موش ها از فریزر 80- درجه سانتیگراد خارج و در راک میکروتیوب اپندورف گذاشته شد تا در دمای محیط آزمایشگاه ذوب شوند.

2-4-3-3-اندازه گیری کلسترول تام با استفاده از کیت کلسترول
از کیت کلسترول شرکت من که بر اساس روش رنگ سنجی آنزیمی کلسترول اکسیداز و پراکسیداز است برای اندازه گیری میزان کلسترول تام استفاده شد.

الف)پیپت کردن
در لوله بلانک 10 میکرولیتر آب مقطر و 1 میلی لیتر معرف کاری ریخته شد.
در لوله استاندارد 10 میکرولیتر محلول استاندارد و 1 میلی لیتر معرف کاری اضافه شد.
در لوله های نمونه 10 میکرولیتر از نمونه مربوطه و 1 میلی لیتر معرف کاری اضافه شد.
پس از مخلوط کردن و قرار دادن لوله ها در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه جذب نوری لوله ها در طول موج 500 نانومتر خوانده شد (دستگاه در مقابل بلانک صفر شد).

ب) محاسبه
غلظت نمونه بر حسب میلی گرم در هر دسی لیتر با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.
(نمونه نوری جذب )/(استاندارد نوری جذب ) × غلظت استاندارد (mg/dl 200)
5-3-3- اندازه گیری تری گلیسرید سرم

1-5-3-3- آماده سازی نمونه ها
میکروتیوب های اپندورف حاوی سرم خون موش ها از فریزر 80- درجه سانتیگراد خارج و در راک میکروتیوب اپندورف گذاشته شد تا در دمای محیط آزمایشگاه ذوب شدند.

2-5-3-3-اندازه گیری تری گلیسرید با استفاده از کیت تری گلیسرید
از کیت تری گلیسرید شرکت من که بر اساس روش رنگ سنجی آنزیمی گلیسرول اکسیداز و پراکسیداز است استفاده شد.

الف) پیپت کردن
در لوله بلانک 10 میکرولیتر آب مقطر و 1 میلی لیتر معرف کاری ریخته شد.
در لوله استاندارد 10 میکرولیتر محلول استاندارد و 1 میلی لیتر معرف کاری اضافه شد.
در لوله های نمونه 10 میکرولیتر از نمونه مربوطه و 1 میلی لیتر معرف کاری اضافه شد.
پس از مخلوط کردن و قرار دادن لوله ها در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه جذب نوری لوله ها در طول موج 500 نانومتر خوانده شد. (دستگاه در مقابل بلانک صفر شد).

ب) محاسبه
غلظت نمونه بر حسب میلی گرم در هر دسی لیتر با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.
(نمونه نوری جذب )/(استاندارد نوری جذب ) × غلظت استاندارد (mg/dl 200)

6-3-3- آماده سازی نمونه های استخوانی جهت مطالعه هیستومورفومتریک

استخوان تیبیای راست پس از برداشت به مدت 3 هفته در محلول فرمالدهید 4% تثبیت شده و به روش اسید فرمیک-سیترات سدیم دکلسیفیه شد. این روش به شرح زیر انجام پذیرفت.
_ دکلسیفیکاسیون به روش اسید فرمیک-سیترات سدیم
در این روش از دو محلول 1 و 2 به شرح زیر استفاده شد:
-محلول 1:حاوی 50 گرم سیترات سدیم و 250 سانتیمتر مکعب آب مقطر
-محلول 2:حاوی 125 سانتیمتر مکعب اسید فرمیک 90% و 125 سانتیمتر مکعب آب مقطر
محلول های فوق به نسبت مساوی با یکدیگر مخلوط شدند. نمونه ها به مدت 7 روز در محلول دکلسیفیکاسیون نگه داشته شده و محلول دست کم یک روز در میان تعویض میشد. پس از دکلسیفیه شدن، نمونه ها به مدت 12 ساعت در آب جاری شسته شدند. انعطاف پذیر شدن نمونه ها به عنوان نشانه دکلسیفیه شدن آنها در نظر گرفته شد.
سپس اپی فیز و متافیز استخوان تیبیا جدا گردید. نمونه ها درون دستگاه پردازشگر اتوماتیک قرار داده شد. اساس کار این دستگاه عبور دادن بافت از الکل های با درجات الکلی افزاینده (از الکل 70%به 80%و 90% و سپس به الکل مطلق) است تا آب گیری از بافت صورت گرفته و واکنش های اضافی درون سلول متوقف شود. سپس دستگاه نمونه ها را به زایلول (برای شفاف سازی) و سپس به پارافین (جهت استحکام بافت) منتقل می کند. زمان لازم حدود 5/17 ساعت در نظر گرفته شد. سپس نمونه ها در قالب های مخصوص قرار داده شدند و با اضافه کردن پارافین مذاب (با دمای ذوب حدود 56 درجه سانتیگراد) به آنها، بلوک هایی برای برش گیری تهیه شدند. از بلوک های پارافینی مقاطع طولی 5 میکرونی تهیه گردید و تمامی مقاطع با هماتوکسیلین-ائوزین رنگ آمیزی شدند (جزئیات روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین در پایان همین فصل آمده است).
پس از رنگ آمیزی، پارامترهای مربوط به استخوان اسفنجی شامل ضخامت ترابکول ها در دو ناحیه اپی فیز و متافیز و نسبت مساحت ترابکول به مساحت بافت در ناحیه اپی فیز تعیین گردید. محل اندازگیری پارامترهای فوق الذکر، دقیقا در ناحیه مرکزی اپی فیز و متافیز به ترتیب با فاصله حدود 5/0 میلیمتر بالاتر از صفحه رشد برای تعیین پارامتر های اپی فیز و در سطح دیافیزی ناحیه ی متافیز برای تعین پارامترهای متافیز در نظر گفته شد.
در هر نمونه ضخامت 6 ترابکول اپی فیز و یا 10 ترابکول متافیز بطور یکسان، اندازه گیری شده و نتیجه به صورت میانگین ضخامت آنها در نظر گرفته شد. در تصویر1-3، چگونگی اندازه گیری ضخامت ترابکول ها در ناحیه اپی فیز آورده شده است. لازم به ذکر است که ضخامت هر ترابکول در قسمت میانی آن اندازه گیری شد.

تصویر 1-3: اندازه گیری ضخامت ترابکول ها در ناحیه اپی فیز پروگزیمال تیبیا (بزرگنمایی 4)

جهت تعیین نسبت مساحت ترابکول ها به مساحت کل بافت، مجموع مساحت های ترابکولهای موجود در مستطیلی به ابعاد 30x 40 µm اندازه گیری شده و بر عدد 1200 تقسیم و به صورت درصد بیان شد. در تصویر 2-3 چگونگی اندازه گیری نشان داده شده است.

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   منبع پایان نامه درباره motivation، tradition

تصویر 2-3: اندازه گیری نسبت مساحت ترابکول به مساحت بافت در ناحیه اپی فیز پروگزیمال تیبیا (بزرگنمایی 4).

تمامی پارامترهای فوق با استفاده از فتومیکروسکوپ دیجیتال متصل به رایانه شخصی با نرم افزار Ziess axio vision LE اندازه گیری شدند.

7-3-3-ارزیابی دانسیته رادیوگرافی نمونه های استخوان

گوه پلهای آلومینیم58 دارای 15 پله است، ضخامت پله اول به اندازه 5/0 میلیمتر آلومینیم بوده و به ترتیب ضخامت هر پله به میزان 25/0 میلیمتر افزوده می شود به طوری که ضخامت پله آخر یا پانزدهم برابر با 4 میلیمتر میشود.
با استفاده از فیلم و کاست ماموگرافی از استخوان تیبیا سمت چپ تمامی موش ها رادیوگراف تهیه شد. اصول ایمنی حفاظت در برابر اشعه در هنگام رادیوگرافی کاملا رعایت شد. به دلیل امکان حالت گماری و مقید سازی آسانتر، رادیوگرافی از استخوانها در حالت جانبی59 انجام شد. گوه پلهای آلومینیمی در تمامی رادیوگرافها در موقعیت ثابتی نسبت به استخوان قرار داده میشد (تصویر3-3). شرایط تابش برای استخوانتیبیا ( mAs = 3و kVp = 50) تنظیم شد. رادیوگرافهای مورد نظر تهیه و با استفاده از دستگاه پروسسور اتوماتیک، ظاهر شدند. در مرحله بعدی ابتدا رادیوگرافهای تهیه شده به صورت کیفی تحت بررسی اجمالی و ابتدایی قرار میگرفت. بعد از آن با استفاده از یک دوربین دیجیتال و با قرار دادن رادیوگرافها بر روی نگاتوسکوپ، عکس دیجیتال از تمامی رادیوگرافها در شرایط یکسان تهیه شد. فتوگرافهای تهیه شده با استفاده از برنامه فتوشاپ به صورت gray scale تبدیل شده و با فرمت tiff ذخیره شدند. سپس با استفاده از برنامه نرم افزاری Image J مراحل بررسی کمی دانسیته روی فتوگرافها انجام گرفت. تصویر گوه پلهای آلومینیومی به عنوان دانسیته مبنا در نظر گرفته شد و برای کالیبره کردن برنامه نرم افزاری از آن استفاده شد. به این صورت که دانسیته رادیوگرافی قسمت زمینهای فتوگراف، معادل صفر میلیمتر آلومینیوم و دانسیته سایر پلهها، معادل با ضخامت پله مزبور، با واحد میلیمتر آلومینیوم بیان شد. پس از کالیبره نمودن برنامه به این شکل، دانسیته استخوانی در اپیفیز و متافیز ابتدایی استخوان تیبیا اندازهگیری و بر اساس میلیمتر آلومینیوم بیان میشد.
لازم به ذکر است اندازگیری ها در قسمت خلفی اپی فیز و 2 میلیمتر پایین تر از صفحه رشد در ناحیه متافیز انجام گرفت.

تصویر 3-3: رادیوگراف تهیه شده از استخوان های تیبیا به همراه گوه پله ای

1-7-3-3 نحوه اندازه گیری دانسیته رادیوگرافی بر اساس mmAl در استخوان های تیبیا با استفاده از نرم افزار
عکس در نرم افزار Image J باز شده، با قرار دادن مربع در صفحه زمینه و بعد از آن بر روی تک تک پله ها دستگاه میزان روشنایی هر پله را به صورت کمّی به ما نشان خواهد داد. در مرحله بعد برای دستگاه تعریف می شود که هر روشنایی معادل چه میزان mmAl می باشد به این صورت که زمینه برابر صفر mmAl تعریف می شود. و اینگونه دستگاه کالیبره می شود. پس از کالیبره شدن دستگاه، با قرار دادن مربع در هر ناحیه دستگاه محاسبه می کند که هر میزان روشنایی برابر چه میزان mmAl می باشد و تمام اطلاعات را به صورت کمّی ارائه می شود. تصویر 4-3 چگونگی اندازگیری دانسیته رادیوگرافی بر اساس mmAl استخوان تیبیا را با نرم افزار نشان می دهد.

تصویر 4-3: اندازه گیری دانسیته رادیوگرافی بر اساس (mmAl) استخوان تیبیا با استفاده از نرم افزار

8-3-3-تجزیه و تحلیل آماری داده ها
مقادیر تمامی داده ها به صورت میانگین(±) احراف معیار بیان شد. داده ها به روش ANOVA یک طرفه و سپس آزمون Tukey مقایسه شده و جهت تحلیل آماری از نرم افزار SPSS استفاده گردید. سطح معنی دار بودن 05/0p برای تمامی مقایسه ها در نظر گرفته شد.

9-3-3- رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین
در این رنگ آمیزی 14 ظرف وجود دارد که به ترتیب عبارتند از ظروف 1 و 2 که زایلول می باشند و بافت به مدت 10 دقیقه در هرکدام نگه داشته شد، ظرف سوم الکل 100 % می باشد که بافت 4 تا 5 مرتبه در این ظرف به طرف بالا و پایین حرکت داده شد (دیپ زده شد). همین کار در ظرف چهارم که الکل 96% و در ظرف پنجم که الکل 70% بود صورت گرفت. ظرف ششم حاوی آب جاری بود که بافت به مدت 5 دقیقه در این ظرف نگه داشته شد. پس از آن بافت 1 تا 2 مرتبه در یک ظرف آب مقطر دیپ زده شد. سپس به ظرف هماتوکسیلین منتقل شده و 5 دقیقه نگه داشته شد و پس از آن در ظرف آب مقطر گذاشته شد تا رنگ های اضافه از روی لام پاک شود. سپس بافت یکبار در ظرف اسید-الکل دیپ زده شد و بلافاصله به ظرف آب جاری منتقل شد تا اسید-الکل اضافه از روی لام پاک شود. سپس در ظرف ائوزین دیپ زده شد. بعد از این، مرحله آبگیری است که با الکل 90% شروع شده و پس از آن الکل 96% و سپس الکل 100% می باشد که لام در هرکدام از این ظروف چند بار دیپ زده شد. سپس مرحله شفاف سازی است که شامل دوظرف زایلول می باشد که لام در هر یک از این ظروف به مدت 10 دقیقه نگه داشته شد. در پایان لام گذاری انجام شد.

فصل چهارم

نتایج
1-4-پارامترهای لیپیدی سرمی
1-1-4- میزان کلسترول تام سرم

نتایج مربوط به اندازه گیری میزان کلسترول سرم در روز 15 در گروه های مختلف در جدول 1-4 آورده شده است. با توجه به استفاده از جیره پر چرب در گروه های2 و 3 و 4 و همچنین عدم شروع درمان با نیاسین تا روز 15، افزایش معنی داری در میزان کلسترول سرمی در گروه های 2 (هیپرلیپیدمیک) (003/0=p)، 3 (هیپرلیپیدمیک درمان شده با دوز رایج نیاسین) و 4 (هیپرلیپیدمیک درمان شده با دوز بالای نیاسین) (001/0( p در هر دو مورد در

دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید