L.rhamnosusرا به دوصورت منجمد-خشک شده34 (بصورت پودری )وسلول تازه به فرمولاسیون شربت سیب و شیرینی جودوسر با روکش شکلات اضافه نمودند که نتایج نشان دادند فیبر موجود در سیب و آرد جو دوسر اثر چندانی در حفاظت سلول ها در حالت فریز درای شده نداشته در حالی که مواد فیبری در pHپایین شربت و شرایط آرد جو دوسر موجب محافظت سلول تازه در دمای 4 و 20 درجه سانتی گراد می گردند[41].

فصل سوم
روش تحقیق(مواد و روش‌کار)

3-1-کشت میکروبی
باکتری های لیوفیلیزه L.acidophilus وrhamnosus L.caseiخریداری وبطور جداگانه در محیط های کشت MRS Broth، تلقیح گردیده و بمدت 24 ساعت تحت شرایط هوازی در 37درجه سانتی گراد جهت فعال سازی باکتری کشت داده شد.
این باکتری ها جهت رسیدن به تعداد مناسب سپس بصورت 10درصد حجمی /حجمی دوباره در محیط کشت MRS Broth تجدید کشت گردیدند .به این صورت که 10 میلی لیتر از محلول کشت مادر به 100 میلی لیتر محلول MRS Broth انتقال داده شد و باکتری تحت شرایط هوازی در37 درجه سانتی گراد بمدت 24 ساعت رشد داده شد.

شکل 3-1) تصاویر میکروسکوپی باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس وکازئی(بترتیب اشکال بالا و پایین)
سپس باکتری ها بکمک سیستم سانتریفیوژ درg 600بمدت 10 دقیقه جداسازی گردیده سلولهای حاصله بطور جداگانه توسط نرمال سالین 0.9 درصد دوبار تحت شرایط ذکر شده پس از شستشو توسط عملیات سانتریفوژ جداسازی گردیدند.به این ترتیب که پس از جداسازی محلول شفاف جمع آوری شده بر سطح فوقانی رسوب حاصله در کف لوله ی حامل محلول سانتریفوژ شده دوباره رسوب حاصله با نرمال سالین مخلوط و مجددا تحت شرایط فوق الذکر سانتریفوژ می گردید.لازم به ذکر است برای این کار به ازای هر گرم محصول نهایی حداقل 1میلی لیتر از کالچر بدست آمده(MRS Broth 24 ساعت کشت داده شده )را مورد سانتریفوژ قرار دادیم. نهایتا باکتری های هر جنس بطور جداگانه در0.5 میلی لیتر نرمال سالین محلول گردیده تا غلظت آن به -cfu/ml رسیده و برای تلقیح مستقیم و یا انکپسولاسیون آماده گردند. [21 ,15 , 33].
تعداد باکتری قبل از تلقیح بکمک روش اندازه گیری OD(Optical density) و روش کشت پور پلیت در MRS-Agar تخمین زده شد و برای انکپسولاسیون و یا تلقیح مستقیم آماده گردید.

3-2-عملیات انکپسولاسیون:
تمامی ظروف شیشهای و محلول ها مورد استفاده در عملیات در دمای 121 درجه سانتی گراد و بمدت 15 دقیقه استریل گردید.دانه های انکپسوله ی آلژینات با استفاده از روش امولسیون که توسط Sheu و Marshal در سال 1993 ابداع گردیده تولید شدند.
تمامی مواد شامل محلول آلژینات سدیم 4 درصد (A)و مخلوط دو محلول آلژینات 2 درصد ومحلول 2 درصد نشاسته ی مقاوم Hi-maize (B)،محلول کلرید کلسیم 0.1مولار، در اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتی گراد و بمدت 15 دقیقه استریل گردیده و تا دمای 38درجه سانتی گراد سرد گردیدند.
20 میلی لیتر از محلول های آلژینات 4درصد و مخلوط آلژینات 2 درصد بهمراه نشاسته ی مقاوم 2 درصد و 4 میلی لیتر از سوسپانسیون میکروبی به سانتریفوژ تیوب انتقال داده شد و مخلوط تا همگن شدن ورتکس گردید.
100 میلی لیتر از روغن سویا حاوی 0.2 درصد ،Tween 80 (امولسیفایر) در یک بشر 500 میلی لیتری اتنقال داده شده و مخلوط آلژینات های نامبرده A وB که با کالچرمورد نظر مخلوط گردیده بودند به صورت قطره قطره به مخلوط در حال هم خوردن (دورrpm 180) بوسیله دستگاه همزن ()اضافه گردید تا مخلوط امولسیون شیری رنگ حاصل گردد.
پس از 5 دقیقه یک مخلوط کاملا یکدست بدست می آید که بوسلیه ی محلول کلرید کلسیم 0.1 مولار به سرعت از کناره ی ظرف جهت عملیات سخت شدن میکروکپسول ها و شکستن امولسیون حاصله به مخلوط اضافه گردید.
نهایتا پس ازیکساعت ماند مخلوط میکروسفرهای تشکیل شده کپسوله های حاصله توسط دستگاه سانتریفوژ در سرعت 300 g و بمدت 10 دقیقه در 41 درجه ی سانتی گراد جداسازی گردیده و دوبار توسط آب مقطر شستشو و مجددا سانتریفوژ گردیدند.

شکل 3-2) میکروانکپسولاسیون بروش ایجادامولسیون[27].

شکل 3-3) انکپسولاسیون

3-3- تولید سس مایونز:
تمامی مواد مورد استفاده در تهیه سس مایونز مانند روغن سویا ، تخم مرغ ، سرکه ، خردل ، شکر و نمک از سوپر مارکت های محلی خریداری گردید.
برای تهیه ی سس مایونز از دستور تهیه مایونز (با مقداری تغییرات جزئی) Chen و همکارانش در سال 2005 استفاده گردید . مواد تشکیل دهنده با درصد مورد استفاده ی آنها) درصد وزنی/وزنی)عبارت بودند از:
سرکه ی حاوی 5 درصد اسید استیک به میزان 9درصد، روغن سویا 74 درصد، تخم مرغ14 درصد، نمک 1 درصد ، وانیلین 0.1 درصد، خردل 0.54 درصد، شکر 1 درصد، فلفل سفید 0.36 درصد .
-مراحل تولید سس مایونز نیز بصورت زیر بوده است:
ابتدا تخم مرغ و سرکه با یکدیگر مخلوط گردیده و سپس تمامی مواد تشکیل دهنده بجز روغن به آن اضافه گردید.سپس مخلوط تا هموژن شدن کامل آن توسط یک همزن مکانیکی بهم زده می شود.
نهایتا روغن بصورت بسیار آرام به مخلوط اضافه شد و البته در همین حین مخلوط فوق با دور حدود rpm 1600 بمدت 1 دقیقه وسپس بادور rpm 2000 بمدت 4 دقیقه ی دیگر همزده شد.مخلوط سس مایونز بدست آمده تا 5 الی 10 درجه ی سانتی گراد سرد وتا موقع مصرف جهت تلقیح نگهداری گردید.

3-3-1:تولید سس مایونز پروبیوتیک:
سس مایونز حاصله به شش بخش 250 گرمی در ظروف مناسب در 6 بخش یا تیمار A,B,C,D,E,F تقسیم گردید. 1 درصد از مخلوط( وزنی/حجمی) باکتری آزاد L.casei و L.acidophilus به ترتیب بچ سسهای مایونز A و Bاضافه گردید .تعداد اولیه باکتری های آزاد برای نمونه تیمارهای A و Bبترتیب درحدود 6 و 5 ( ) بوده است.
نمونه تیمارهای C وD سس مایونز بترتیب با باکتری های تازه انکپسوله شده ی L.casei و L.acidophilus در پوشش دانه های آلژینات کلسیم 4% مخلوط گردیدند. تعداد اولیه ی باکتری های موجود در این نمونه ها بترتیب برای نمونه ی C برابر 3 ( ) و برای نمونه D برابر 3 ( ) بوده است.
همچنین باکتری های میکروانکپسوله شده ی L.casei و L.acidophilus در پوشش دانه های ریز کپسول حاوی مخلوط آلژینات کلسیم 2 درصد و نشاسته مقاوم Hi-maize 2 درصد با نمونه های سس مایونز E و F تلفیق گردید.تعداد باکتری های پروبیوتیک نمونه های E و F حدوا بترتیب برابر 9.8 و 4 ( ) بوده است.
تمامی نمونه های A,B,C,D,E,F در 3 ظرف جداگانه بعنوان 3 تکرار برای هر نمونه آماده سازی گردیدند.
3-4-اندازه گیری تعداد باکتری ها ی تلقیح شده:
3-4-1:شمارش باکتری قبل از تلقیح به سس مایونز بروش OD :
برای اندازگیری روند رشد باکتری های مورد نظر در نمونه ها وهمچنین تعیین تعداد باکتری مورد نظر در درون محیط کشت مادر که قرار بود پس از جداسازی باکتری توسط سانتریفوژ بصورت مستقیم (آزاد) یا انکپسوله در ماده غذایی تلقیح گردد، علاوه بر استفاده از روش پورپلیت، از روش دانسیته نوری استفاده شد.
جهت انجام آزمایش از کشت قبلی میزان 10 سی سی برداشته و در داخل 100 سی سی محیط کشت ام-آر-اس براث جدید تزریق کردیم و در انکوباتور 37 درجه به مدت 24 ساعت نگهداری کردیم. پس از 24 ساعت 10 سی سی از این محیط کشت جدید را برداشته و در درون لوله های آزمایش ریخته و توسط آب مقطر رقت سازی کردیم. سپس جذب هر رقت تهیه شده را توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر جذب مولکولی (آب مقطر به عنوان شاهد) خواندیم. همچنین همزمان از هر رقتی که جذب آن را خواندیم 1/0 سی سی برداشته و در محیط کشت ام-آر-اس آگار به روش پورپلیت کشت دادیم. پس از 24 ساعت نگهداری در انکوباتور میزان تشکیل کلنی بسیار زیاد بوده و قابل شمارش نبودند. در نتیجه مجددا مراحل انجام شد و لی اینبار رقت سازی بیشتری صورت گرفت. سپس طبق فرمول زیر میزان تعداد باکتری ها در هر رقت تهیه شده بدست آمد و نمودار دانسیته نوری رسم شد.

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   تحقیق رایگان با موضوع TBE، تهیه، بروماید

3-4-2:شمارش تعداد باکتری ها پس از تلقیح در سس مایونز بروش کشت پورپلیت
تعداد باکتری های موجود در سس های مایونز پروبیوتیک تولید شده دقیقا پس از تولید سس (در زمان صفر) و همچنین در طی 92 روز مدت نگهداری در دمای c° 5 بروش کشت پورپلیت در محیط کشت جامد MRS-Agar(شارلو-اسپانیا)، بصورت زیر انجام گردید.
ابتدا یک گرم از نمونه ی سس مایونز حاوی باکتری پروبیوتیک آزاد تولید شده را در شرایط استریل در آب مقطر استریل شده به حجم10 میلی لیتر رسانده شد و با دستگاه ورتکس مخلوط را بصورت همگن در آوردیم.سپس از مخلوط بدست آمده 1میلی لیتر برداشته و در لوله ی آزمایش استریل انتقال و با 9 میلی لیتر آب مقطر استریل مخلوط و ورتکس نمودیم.به این ترتیب مخلوط اولیه دارای 0.1رقت و مخلوط دوم دارای رقت 0.01 باکتری آزاد می باشد.به همین ترتیب رقت های تا از باکتری آزاد اولیه تهیه گردید.تمامی عملیات در محیط استریل و در شعاع حداکثر یک متری شعله انجام گردید.
سپس محیط کشت MRS-Agar (استریل و ذوب شده در دمای 37 تا 40 درجه سانتی گراد)را آماده نمودیم.پلیت های استریل برچسب گذاری شده با نام و رقت مورد نظر هر باکتری در محیط استریل و در کنار شعله آماده گردیده و بکمک پیپیت شده میزان 0.1 میلی لیتر از هرکدام از رقت های مورد نظر در 3 تکرار متوالی به پلیت خالی از محیط کشت انتقال داده شد.سپس محیط کشت استریل آگار در دمای مناسب به آرامی بر سطح پلیت ریخته شده و بصورت عدد 8 انگلیسی پلیت ها برروی سطح حرکت داده شده تا محیط کشت و باکتری به مدت حداقل 2 دقیقه مخلوط گردند.پس از بستن آگار، دوباره مقداری از محیط کشت MRS-Agar در دمای مناسب بصورت مایع بر سطح پلیت ریخته می شد تا سطح محیط بصورت بی هوازی در آمده باکتری بهتر رشد نماید.پس از بستن آگار رویی تمامی پلیت ها توسط پارافیلم سیل شده و در دمای 37 درجه سانتی گراد بمدت 48 ساعت انکوباسیون می گردید.
در مورد باکتری های انکپسوله شده بجز بخش اولیه ی عملیات تمامی عملیات کشت مشابه میباشد.بدین صورت که یک گرم از نمونه های سس مایونز حاوی باکتری پروبیوتیک انکپسوله شده با هر یک از تیمارهای مورد نظر، (در شرایط استریل) در 10 میلی محلول بافر فسفاته استریل شده(0.1 مولار و با pH برابر با7 )به حجم10 میلی لیتر رسانده شد و سپس توسط همزن با دور حداقل rpm 120 بمدت 10 دقیقه جهت لیز کردن کپسول همزده شد.
سپس محلول یکنواخت حاصله که حاوی رقت 0.1 باکتری آزاد شده بود را به روشی که در قسمت قبل توضیح داده شد با آب مقطر استریل تا رقت رقیق سازی و کشت پورپلیت شدند.نمونه های فوق نیز در مدت 48 ساعت پس از سیل شدن پلیت بوسیله ی پارافیلم در 37 درجه ی سانتی گراد در انکوباتور کشت داده شدند.
تمامی پلیت ها پس از تکمیل مدت کشت، بکمک دستگاه کلنی کانتر شمارش گردیدندلازم به ذکر است تنها نمونه های حاوی 30 الی 300 کلنی شمارش می گردید و میانگین سه تکرار ثبت می گردید
.تعداد باکتری بر حسب ( ) به اینصورت محاسبه میگردید که تعداد کلنی شمارش شده بر سطح بالایی و یا عمقی هر پلیت در عکس رقت تهیه شده و در عدد 10 (میزان تلقیح هر رقت در پلیت، 0.1 بوده است) ضرب گردیده تا تعداد نهایی باکتری فعال و زنده ی موجود در هرنمونه سس مایونز بدست آید.
تعداد کلنی شمارش شده × عکس رقت (محلولی که در پلیت کشت شده ) 10= تعداد باکتری
فرمول 1:محاسبه تعداد باکتری زنده هر نمونه

3-5-آنالیز های فیزیکی و شمیایی نمونه ها:
pH

دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید