پنهان لکوسیتوزئون‌ها در فصل زمستان می‌باشند. طی فصول گرم پشه‌های سیاه (سیمولیده) و پشه‌های کوچک (کولیکوئیدها) از سطح بدن حاملها تغذیه کرده، لکوسیتوزئون‌ها را دریافت می‌کنند. انگلها درون حشرات محتمل اسپوروگونی شده و به غدد موجود در محوطه دهانی آنها وارد می‌شوند. سپس حشرات به عنوان ناقل عمل نموده، هنگامی که از سطح بدن پرندگان حساس جوان تغذیه می‌کنند، لکوسیتوزئون را به آنها انتقال می‌دهند. پرندگانی که از این بیماری جان سالم به در می‌برند، دوباره حامل بیماری می‌شوند.
نشانه‌های بالینی
شروع بیماری معمولأ به صورت ناگهانی می‌باشد و در مدت کوتاهی تعداد زیادی از پرندگان نشانه‌های بیماری را بروز می‌دهند. کسالت، بی اشتهایی، تشنگی، از دست دادن تعادل، ضعف و کم خونی وجود دارد. ممکن است تنفس پرنده سریع و مشکل باشد. دوره بیماری اغلب کوتاه است و پرندگان مبتلا در عرض چند روز یا می‌میرند یا بهبود می‌یابند. میزان مرگ و میر متغیر ولی اغلب بالا می‌باشد.
جراحات
1- در پرندگانی که چند روزی زنده می‌مانند ممکن است بزرگ شدن کبد و طحال و شواهدی از کم خونی وجود داشته باشد. بزرگ شدن طحال مشخص ترین ضایعه این بیماری می‌باشد.
2- در زیر میکروسکوپ، درمغز تعدادی از پرندگان که عدم تعادل داشته‌اند، شیزونت‌های بزرگ (مگالوشیزونت‌ها) دیده می‌شود. شیزونت‌های کوچک انگل غالبأ در کبد مشاهده می‌گردند.
تشخیص
با بررسی گسترش خونی پرنده مبتلا، بعد از رنگ آمیزی آن به روش گیمسا یا رایت، این بیماری را می‌توان تشخیص داد. بعضی از سلولهای خونی حاوی گامت‌های لکوسیتوزئون می‌باشند. معمولأ شکل سلولهای مبتلا به وسیله گامت‌ها تغییر می‌کند واندازه آنها به طور مشخصی افزایش می‌یابد. درمقاطع بافت شناسی کبد و مغز، معمولأ شیزونت‌ها و مگالوشیزونت‌ها مشخص می‌باشند.

2-4- واکنش زنجیر‌های پلی مراز( PCR )
کاربرد:
تکنیک PCR کاربرد‌های نامحدودی در عرصه‌های مختلف زیست ملکولی دارد. علت اصلی این امر این است که DNA الگو به کار رفته در PCR را می‌توان از منابع مختلف تامین کرد و مورد استفاده قرار داد.
به طور کلی PCR به دو منظور اصلی به کار برده می‌شود :
1-تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن
2-بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA
برخی کاربرد‌ها یا این تکنیک شامل:
– تشخیص عوامل عفونی (ویروس‌ها، باکتری‌ها، انگل‌ها و… )
– تشخیص جهش‌ها (P.N.D و سرطان‌ها و… )
– کلون سازی ژن
– تعیین توالی‌های کروموزومی انسان در سلول‌های هیبریدی( هترو کاریون‌ها )
– تعیین جنسیت جنین
اساس کار
توسعه و انجام PCR یک تجربه در علم بیولوژیکی ملکولی ایجاد می‌کند. به کمک این تکنیک می‌توان ناحیه خاصی از ژن را که بین دو ناحیه شناخته شده DNA است تکثیر نموده تکثیر DNA با استفاده از پرایمر‌ها و ملکول‌های DNA الگو انجام می‌گیرد که تحت شرایط خاص پرایمر‌ها به DNA الگو متصل شده و با در دسترس بودن عوامل دیگرهمانندسازی DNA، ساخت قطعه‌ای از DNA آغاز می‌گردد. اگر شرایط مهیا باشد می‌توان از یک قطعه DNA در 30 سیکل و در مدت کوتاهی تا 5/1 قطعه به دست آورد.
برای انجام PCR دو پرایمر مکمل DNA مورد احتیاج است این دو پرایمر در جهت مخالف با DNA هدف هیبرید می‌شوند DNA بین آن تکثیر می‌یابد. برای سنتز DNA، یک DNA پلی مراز مقاوم به حرارت مورد نیاز است. آنزیم (Taq) پلی مراز که از یک باکتری گرما دوست به نام ترموس اکواتیکوس بدست می‌آید. به عنوان مهم ترین آنزیم مورد استفاده برای PCR محسوب می‌گردد.

2-4-1- مواد و وسایل لازم برای انجام برای انجام آزمایش PCR
– DNA هدف
– PCR Buffer 10X
– آنزیم DNA پلی مراز (Taq DNA Polymerase 5u/ul )
– نوکلئوتید‌ها یا دزوکسی نوکلئوتید تری فسفات (dNTP 10Mm)
– کلرورمنیزیم (MgCl2 50Mm )
– پرایمر
– بافر PCR و کمک کننده ها
– آب مقطر
– میکروتیوب 5/0 میلی لیتری
– میکروسانتریفیوژ

2-4-2- سنتز
سنتز چند مرحله دارد :
1-مرحله واسرشت سازی قطعات DNA
در این مرحله حرارت باعث تک رشته‌ای شدن ملکول‌های دو رشته‌ای DNA در حضور آغاز گرها، چهار نوع dNTP¸ بافرPCR و آنزیم DNA پلی مراز مقاوم به حرارت می‌شود. درجه حرارت این مرحله معمولا بین 95-93 درجه سانتی گراد است.
2-مرحله هم سرشت سازی:
با پایین آوردن درجه حرارت تا حد 65-37 درجه سانتی گراد بسته به TM مورد استفاده موجبات اتصال آغازگرها به DNA تک رشته شده فراهم می‌آید. پرایمرها 30-18 نوکلئوتید می‌باشند و اگر امکان داشته باشد پرایمرها را به گونه‌ای طراحی می‌کنند که TM پرایمر‌ها یکسان باشند.
برای بدست آوردن TMپرایمر هااز فرمول زیر استفاده می‌شود :
(تعداد بازهایC¸G) ×4+(تعداد بازهایTM=2×(T¸A
درجه حرارت مناسب برای جفت شدن پرایمر و DNA هدف 5-3 درجه سانتی گراد زیر TM می‌باشد چون آنزیم پلی مراز در درجه حرارت‌های مختلف فعال است از همان درجه حرارت لازم برای جفت شدن پرایمر و DNA هدف به منظور طویل شدن DNA نیز استفاده می‌شود.
3-بسط آغازگرها :
در این مرحله آنزیم DNA پلی مراز از 3 انتهای پرایمر همانند سازی می‌کند. این آنزیم در 72 درجه سانتی گراد بین 45 تا 100 نوکلئوتید در ثانیه همانند سازی می‌کند که این میزان بستگی به PH بافر غلظت نمک و DNA هدف دارد. سپس این فرایند حداقل برای 20 سیکل دیگر تکرار می‌شود.
در فرایند PCR¸ درجه حرارت 97-94 درجه سانتی گراد برای جدا شدن دو زنجیره DNA و 75-55 درجه سانتی گراد برای همانند سازی لازم است ولی نهایتا سیکل آخر همانند سازی22 5 دقیقه طول می‌کشد تا تمامDNA به رشته‌های دو زنجیره‌ای تبدیل شود.

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   منبع پایان نامه درباره tradition

2-4-3- تشخیص و تجزیه فراورده‌های PCR:
فراورده‌های PCR عبارت از یک قطعه (یا قطعاتی) از DNA هستند که طول آنها معمولا برابر با ناحیه حد وسط در آغاز گر می‌باشد.
برای تشخیص و تعیین هویت قطعات تکثیر یافته از روش‌های مختلف می‌توان سود برد که این موارد عبارتند از :
الف) ژل الکتروفورز
ب) تشخیص آنی ناحیه تکثیری
ج) تشخیص ایمونولوژیکی فراورده‌های PCR
د) ارزیابی به وسیله جرقه با SPA23
از مجموع موارد فوق تنها به توزیع مختصری در مورد روش ژل الکتروفورز که آسانترین و متداول ترین روش مورد استفاده است می‌پردازیم.
ژل الکتروفورز :
آسانترین، متداول ترین روش مورد استفاده برای تشخیص و تجزیه فراورده PCR الکتروفورز است. الکتروفورز مقداری از فراورده‌های PCR بر روی ژل آگارز یا ژل پلی اکریلامید، رنگ آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید( یک ماده رنگی که دارای خاصیت فلورسنت است) و آنگاه مشاهده ژل در زیر فرابنفش(uv) یکی از ساده ترین روش‌ها برای تشخیص و بررسی فراورده‌های PCR پس از رنگ آمیزی و با تابش نور uv به ژل مشاهده DNA و ژل، امکان پذیر می‌گردد. حال می‌توان از ژل عکس برداری کرد و نتیجه را ثبت کرد.
مارکر‌های مقیاسی و فراورده‌های PCR مربوط به کنترل آزمایش را می‌توان در چاهک‌های جانبی ژل قرار داد تا امکان تعیین دقیق اندازه قطعات تکثیر شده فراهم آید. مارکر‌های DNA در اندازه‌های مختلف به صورت تجاری قابل تهیه می‌باشند.

فصل سوم
«مواد و روش کار»

3-1- نمونه گیری
پس ازهماهنگی با کشتارگاه‌های صنعتی استان اصفهان واقع در شهرستان‌های تیران و کرون و نجف آباد تعداد 200 نمونه خون و200 نمونه کبد جمع آوری گردید توضیح اینکه از هر گله تعداد 10نمونه خون و 10 نمونه کبد اخذ گردیده است. سپس نمونه‌ها در کنار یخ به آزمایشگاه زنده یاد دکتر فرشاد زمانی دهکردی واقع در دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انتقال داده شد. نمونه‌ها تا زمان انجام آزمایش در دمای20- درجه سانتی گراد نگه داری شدند.

3-2- استخراج DNA از کبد با استفاده از کیت
استخراج DNA با استفاده از کیت ساخت شرکت سینا ژن ایران (DNPTM Kit) طبق دستور العمل کیت به صورت زیر انجام شد.
1- به 100µg از نمونه‌های کبد گرفته شده، مقدار 100µl بافرپرتئاز و 5µl پرتئاز اضافه شد و به مدت یک ساعت در دمای 55 درجه در Heater قرار داده شد تا آنزیم اثر کند.
2- مقدار 250محلول Lysis اضافه شد و به مدت 1 دقیقه ورتکس شدید انجام شد.
3- 300µl از Percipitation به آرامی به تیوب‌ها اضافه گردید و ده مرتبه واژگون شد (Inverting).
4- نمونه‌ها به مدت یک شب در دمای 20- درجه سانتی گراد قرار داده شدند.
5- نمونه‌ها به مدت 8 دقیقه در13000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی خارج شد.
6- 500µl از بافرشستشو دهنده (Wash Buffer) به تیوب‌ها افزوده و 5مرتبه واژگون شد.
7- نمونه‌ها به مدت 5دقیقه در 13000 دور بر دقیقه سانتریقیوژ و مایع رویی خارج شد.
8- تیوب‌ها را به صورت وارونه روی یک کاغذ تمیز فشار داده تا آبگیری شود.
9- نمونه‌ها را به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد در داخل Heater به منظور خشک کردن رسوب حاصله به صورت در باز قرار داده شد به طوریکه تیوب‌ها پس از این مدت بو ندهند.
10- پس از خشک شدن رسوب حاصله در 50µl آب مقطرحل شد.
11- به مدت 5 دقیقه با دور rpm13000 سانتریفیوژ می‌شود.که محلول رویی حاوی DNA می‌باشد.

3-3- استخراج DNA از خون با استفاده از کیت
استخراج DNA با استفاده از کیت ساخت شرکت سینا ژن ایران (DNPTM Kit) طبق دستور العمل کیت به صورت زیر انجام شد.
1- 200µlخون بهمراه 700µlLysis و به مدت 1 دقیقه ورتکس شدید انجام شد.
2- 500µl از Percipitation به آرامی به تیوب‌ها اضافه گردید و ده مرتبه واژگون شد (Inverting).
3- نمونه‌ها به مدت یک شب در دمای 20- درجه سانتی گراد قرار داده شدند.
4- نمونه‌ها به مدت 8 دقیقه در13000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی خارج شد.
5- 500µl از بافر شستشو دهنده24 به تیوب‌ها افزوده و 5 مرتبه واژگون شد.
6- نمونه‌ها به مدت 5دقیقه در 13000 دور بر دقیقه سانتریقیوژ و مایع رویی خارج شد.
7- تیوب‌ها را به صورت وارونه روی یک کاغذ تمیز فشار داده تا آبگیری شود.
8- نمونه‌ها را به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد در داخل Heater به منظور خشک کردن رسوب حاصله به صورت در باز قرار داده شد به طوریکه تیوب‌ها پس از این مدت بو ندهند.
9- پس از خشک شدن رسوب حاصله در 50µl آب مقطرحل شد.
10- به مدت 5 دقیقه با دور rpm13000 سانتریفیوژ می‌شود.که محلول رویی حاوی DNA می‌باشد.

3-4- آزمایش PCR
جهت تکثیر قطعه ژن کد کننده آنتی ژن انگل هیستوموناس مله اگریدیس، از 2 زوج پرایمر اختصاصی منتشر شده توسط وی لی و همکاران درسال 2011 (22) که با استفاده از توالی ژنوم شماره ژن بانک AF293056 (33) توسط شرکت سینا ژن سنتز شده است، مورد استفاده قرار گرفته است :
Hmf 5´-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3´(forward)
Hmr5´-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3´(reverse)

3-4-1- روش کار
جهت انجام آزمایش PCR و تکثیر ژن‌های مورد نظر از دستگاهMastercycler Gradiant Eppendorf ¸ Germany)) با حجم نهایی 25 میکرو لیتر شامل: 1 میکروگرم نمونه DNA و 1میکرولیتر از هر پرایمر، 2 میکرولیتر منیزیوم کلراید و 200 میکرولیتر از dNTP و 5/2 میکرولیتر از بافر 10x و 1 میکرولیتر از آنزیم Taq پلیمراز بود (Fermentas, Germany). واکنش

دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید